Some content on this page is not available in English and displayed by default in the language currently available.

Инструкция к набору для определения апоптоза и митохондриального мембранного потенциала

Mitochondrial Membrane Potential Apoptosis Kit — готовый к работе набор, предназначенный для быстрого и удобного анализа двух ключевых показателей апоптоза: экстернализации фосфатидилсерина (с помощью аннексина V-AF 488) и изменений потенциала митохондриальной мембраны (с помощью LumiTracker® Mito Red CMXRos).

Аннексин V (или Аннексин A5) принадлежит семейству аннексинов, внутриклеточных белков, связывающих фосфолипиды. Аннексин V часто используется для определения апоптотических клеток, благодаря его способности специфически связываться с фосфатидилсерином (ФС), который на ранних стадиях апоптоза перемещается со внутренней стороны клеточной мембраны во внешнюю. Настоящий набор содержит рекомбинантный аннексин V, конъюгированный с AF 488, — ярким фотостабильным зеленым флуорофором со спектральными характеристиками, аналогичными FITC.

LumiTracker Mito Red CMXRos — катионный красный флуоресцентный краситель, который пассивно диффундирует через плазматическую мембрану и избирательно накапливается в активных митохондриях в зависимости от мембранного потенциала в них. Здоровые клетки обладают высоким митохондриальным мембранным потенциалом, и его снижение считают маркером ранней стадии апоптоза.

После окрашивания аннексином V-AF 488 и красителем LumiTracker® Mito Red CMXRos живые клетки будут иметь слабую зеленую и интенсивную красную флуоресценцию; апоптотические клетки, наоборот, будут обладать высокой зеленой и низкой красной флуоресценцией. Эти две популяции клеток легко различаются с помощью проточного цитометра, при этом оба красителя способны возбуждаться линией 488 нм аргоно-ионного лазера.

Набор содержит все необходимые реагенты для мечения апоптотичеких клеток конъюгатом аннексина V с AF 488 и определения митохондриального мембранного потенциала с помощью красителя LumiTracker® Mito Red CMXRos.

Kit components

Kit component Count
21372
50 assays
21515, Annexin V-AF 488 conjugate, 5 ug 1
83215, Annexin V Binding Buffer, 5×, 15 mL 1
15050, DMSO (dimethyl sulfoxide), labeling grade, 1 mL 1
2251-50ug, LumiTracker® Mito Red CMXRos, 50 ug 3

Transportation: at room temperature for 1 week. Store at -20 °С for 9 months.

Shelf life 9 months.

Прежде чем начать

  • Обычно используемая концентрация LumiTracker® Mito Red CMXRos для окрашивания клеток составляет 25–500 нМ. Рабочее разведение зависит от типа и плотности клеток и должно быть определено экспериментально.
  • Рекомендуемые концентрации аннексина V-AF — от 2 до 10 мкг/мл, в зависимости от исследуемой клеточной культуры. Перед экспериментом необходимо опробовать разные разведения аннексина V-AF для определения оптимальной концентрации.
    Важно! Аннексин V можно использовать в качестве маркера апоптоза только в клетках с интактной плазматической мембраной. При нарушении целостности плазматической мембраны аннексин V может связываться с ФС внутри клетки и давать ложноположительный результат.

Приготовление растворов

  1. Растворите содержимое пробирки с лиофилизированным аннексином V-AF (21515) в 250 мкл деионизованной воды.
    Важно! Разведенный рекомбинантный белок необходимо хранить защищенным от света при температуре 2-8°C. В растворе конъюгат стабилен в течение месяца. При длительных экспериментах рекомендуется приготовить аликвоты и хранить их при температуре −20°С. Избегать повторного замораживания!
  2. Приготовьте необходимый объём 1× буфера для связывания, смешав 1 часть 5× буфера для связывания с 4 частями деионизованной воды.
  3. Приготовьте 10 мМ стоковый раствор красителя LumiTracker® Mito Red CMXRos, добавив 9,4 мкл ДМСО (15050) в пробирку с красителем LumiTracker® Mito Red CMXRos (2251-50ug). Неиспользованную часть стокового раствора можно хранить при температуре ≤—20°C до 1 мес.
  4. Приготовьте 10 мкМ рабочий раствор красителя LumiTracker® Mito Red CMXRos. Для этого добавьте пипеткой 1 мкл 10 мМ стокового раствора LumiTracker® Mito Red CMXRos в 1000 мкл среды.

Окрашивание клеток

  1. Индуцируйте апоптоз в клетках необходимым способом. Подготовьте отрицательный контроль, инкубируя клетки в отсутствие индуцирующего агента. Подготовьте положительный контроль некроза, инкубируя клетки с 2 мМ перекисью водорода в течение 4 ч при 37°C.

  2. Адгезированные клетки аккуратно снимите с поверхности роста подходящим способом. С суспензионными клетками начинайте работу со следующего пункта.
  3. Отберите 1 мл суспензии клеток (от 1×105 до 1×106 клеток/мл) в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Для проточной цитометрии необходимо заготовить дополнительные пробирки с соответствующими контролями: (1) неокрашенные клетки (отрицательный контроль для настройки прибора); (2) клетки, окрашенные только аннексином V-AF; (3) клетки, окрашенные только LumiTracker® Mito Red CMXRos (для настройки компенсации); а также пробирку (4) с экспериментальными клетками (двойная окраска аннексином V-AF и LumiTracker® Mito Red CMXRos).
  4. В пробирки (3) и (4) добавьте по 4 мкл 10 мкМ раствора LumiTracker Mito Red CMXRos, хорошо перемешайте.
  5. Инкубируйте клетки в темноте в течение 15–45 мин в условиях, необходимых для данного типа клеток.
  6. Промойте клетки один раз охлаждённым PBS (рН 7,4) и один раз 1× буфером для связывания.
  7. Ресуспензируйте клетки в 100 мкл холодного 1× буфера для связывания.
  8. В пробирки (2) и (4) добавьте по 5-10 мкл раствора аннексина V-AF, инкубируйте в течение 10-15 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте.
  9. Без предварительной отмывки добавьте 400 мкл 1x буфера для связывания в каждую пробирку.
  10. Окрашенные клетки храните при температуре 2-8°C в защищенном от света месте до проведения анализа.

Проточная цитометрия

  1. Для цитофлуориметрического анализа апоптоза клеток с помощью аннексина V-AF и LumiTracker® Mito Red CMXRos помимо целевого окрашивания необходимо приготовить контроли (см. выше).
  2. Анализ связывания аннексина V-AF 488 проводят с использованием детектора сигнала FITC.
  3. Анализ клеток, окрашенных LumiTracker® Mito Red CMXRos, осуществляют с помощью детектора сигнала фикоэритрина.
  4. Для корректного разведения красителей по разными каналам детекции может потребоваться отдельная настройка компенсации.

Флуоресцентная микроскопия

  1. Отберите каплю суспензии с окрашенными клетками и поместите ее на предметное стекло. Накройте клетки покровным стеклом.
  2. В качестве альтернативы, адгезированные клетки можно окрашивать непосредственно на покровном стекле. После окрашивания переверните покровное стекло на предметное, так, чтобы клетки находились между предметным и покровным стёклами.
  3. (Опционально) Клетки после окрашивания и перед визуализацией можно промыть 1х буфером для связывания и зафиксировать в 2% параформальдегиде. Не фиксируйте клетки перед инкубацией с аннексином V-AF, поскольку любое нарушение клеточной мембраны может вызвать неспецифическое связывание аннексина V с ФС на внутренней поверхности клеточной мембраны.
  4. Исследование клеток под флуоресцентным микроскопом осуществляют, используя соответствующий набор фильтров.

Related kits

Mitochondrial Membrane Potential Apoptosis Kit, with LumiTracker® Mito Red CMXRos & Annexin V-AF 488

The ready-to-use kit for assaying two key indicators of apoptosis: the externalization of phosphatidylserine and alterations in mitochondrial membrane potential.
Show pricing
Cat. # Quantity Price Lead time
21372
50 assays
$460 1 days
Found better price? Let us know and we will propose the way forward!
Your item has been added. View your cart or proceed to checkout
The count of items is incorrect.