Unfortunately, this page is not available in English. This is the Russian version.

Набор для выделения геномной ДНК Lumiprobe

Набор предназначен для быстрого (не более 1 часа) выделения геномной ДНК из различных объектов (грам- бактерий, тканей растений и животных, культур клеток, клеток крови, цельной крови, соскоба буккального эпителия) на спин-колонках. Максимальный выход ДНК — 20 мкг, OD 260/280 1,7-1,8.

Состав набора (рассчитан на выделение 50 образцов ДНК):

Компонент набораКоличество
Колонки с сорбентом 50 шт
Пробирки для сбора проскока 50 шт
Раствор для лизиса эритроцитов, 10х 1×50 мл
Лизирующий компонент I 1×50 мл
Лизирующий компонент II 1×30 мл
Раствор для преципитации 1×15 мл
Промывочный буфер A (с GuHCl) 1×30 мл
Промывочный буфер B, 5х (разбавляется этанолом*) 2×10 мл
Элюирующий буфер 1×10 мл
РНКаза А (10 мг/мл) 2×0,15 мл
Изопропанол 1×30 мл
Корунд 1×25 г

Хранить при комнатной температуре, срок хранения 1 год.

*Этанол не входит в набор

Перед началом работы

Добавьте 40 мл 96% этанола к 10 мл промывочного буфера B (концентрат 5х), поставьте отметку о добавлении этанола на крышке.

При наличии осадка в Лизирующих компонентах I и IIпромывочном буфере А нагрейте их не более чем до 50 С до полного растворения осадка.

Весь протокол выполняется при комнатной температуре, все центрифугирования при 10000-13000 об/мин.

Ориентировочные выходы геномной ДНК:

  • 10^8 клеток грам-бактерий — 5-10 мкг
  • Лист растения — 10-20 мкг
  • Хвоя — 5-7 мкг
  • Мицелий грибов — 2-5 мкг
  • Хвост мыши — 7-14 мкг
  • Почка мыши — 10-20 мкг
  • Сердце мыши — 7-14 мкг
  • Печень мыши — 10-15 мкг
  • Цельная кровь, 100 мкл — 0,6 мкг
  • Соскоб буккального эпителия — 0,8-1 мкг
  • Лейкоциты, выделенные из 1 мл крови — 4-5 мкг

Образцы для выделения ДНК

  • Кровь
  • Для выделения ДНК из цельной крови рекомендуется брать не более 100 мкл образца.

    В случае если планируется предварительно выделить лейкоциты, рекомендуется брать 1-2 мл крови.

  • Клеточные культуры.
  • Рекомендуется брать не более 10^8 клеток бактерий или 10^7 клеток млекопитающих.

  • Ткани растений и животных
  • Рекомендуется брать не более 100 мг ткани. В состав набора входит корунд 50 мкм. При гомогенизации непосредственно в Лизирующем компоненте I в ступке с пестиком или в 1,5 мл пробирке с использованием пестика-гомогенизатора его добавление способствует полной деструкции образца и облегчает процесс гомогенизации. Гомогенизация образца в ступке с пестиком является предпочтительным методом, так как при этом обеспечивается наиболее полное разрушение тканей. Удовлетворительного результата позволяет добиться и пестик-гомогенизатор, однако выход ДНК при прочих равных условиях ниже.

    Возможна гомогенизация образца в жидком азоте с последующим переносом в пробирку с Лизирующим компонентом I. В этом случае необходимо добавить 100 мкл стерильной воды в пробирку с образцом после гомогенизации.

Протокол выделения ДНК из тканей растений и животных

  • 1а.(если используется пестик-гомогенизатор) 20-100 мг ткани поместите в пластиковую пробирку на 1,5 мл, добавьте 200 мкл Лизирующего компонента I, 70-100 мг корунда и гомогенизируйте образец с помощью пестика-гомогенизатора. После гомогенизации добавьте еще 450 мкл Лизирующего компонента I. Добавьте 5 мкл раствора РНКазы, перемешайте.
  • 1б. (если используется фарфоровая ступка) В ступку поместите 100 мкл стерильной воды, 20-100 мг ткани, 200 мкл Лизирующего компонента I, 300 - 500 мг корунда и гомогенизируйте смесь в ступке. После гомогенизации добавьте еще 450 мкл Лизирующего компонента I, перемешайте, перенесите смесь в 1,5 мл пробирку. Добавьте 5 мкл раствора РНКазы, перемешайте.
  1. Инкубируйте полученную смесь 20 мин при 50°С. Добавьте к образцу 350 мкл Лизирующего компонента II, перемешайте.
  2. Центрифугируйте 10 мин, 10000 - 13000 об/мин, перенесите 800 мкл супернатанта в новую пробирку на 1,5 мл.
  3. К 800 мкл лизата добавьте 200 мкл изопропанола, перемешайте.
  4. Поместите колонку в пробирку для сбора проскока, нанесите на колонку 800 мкл лизата, центрифугируйте 60 сек, 10000-13000 об/мин. Проскок слейте.
  5. Нанесите на колонку 500 мкл промывочного буфера А, центрифугируйте 30-45 сек, 10000-13000 об/мин. Проскок слейте.
  6. Нанесите на колонку 500 мкл промывочного буфера B, центрифугируйте 30 сек, 10000-13000 об/мин. Проскок слейте. Повторите этот этап еще раз.
  7. Центрифугируйте пустую колонку 30 сек, 10000-13000 об/мин.
  8. Поместите колонку в новую пробирку на 1,5 мл, нанесите на колонку 50-100 мкл элюирующего буфера. Инкубируйте 1 мин при комнатной температуре, затем центрифугируйте 60 сек, 10000-13000 об/мин. Выделенная ДНК находится в элюате.

Протокол выделения ДНК из культур клеток и лейкоцитов

Для выделения лейкоцитов из цельной крови приготовьте 1х раствор для лизиса эритроцитов путем разбавления 10х раствора для лизиса эритроцитов деионизованной водой. В 15 мл пробирке смешайте 1 мл цельной крови и 14 мл 1х раствора для лизиса эритроцитов, перемешайте и инкубируйте 5 мин при комнатной температуре. Центрифугируйте пробирку 5 мин, 300g, надосадочную жидкость слейте, лейкоциты находятся в осадке. 

  1. Ресуспендируйте осадок клеток в 100 мкл PBS. Перенесите суспензию в новую 1,5 мл пробирку.
  2. Добавьте в пробирку 550 мкл Лизирующего компонента I и 5 мкл раствора РНКазы, перемешайте.
  3. Инкубируйте полученную смесь 20 мин при 50°С. Добавьте к образцу 300 мкл Лизирующего компонента II, перемешайте.
  4. (Опционально) Если лизат, полученный на предыдущем шаге, содержит нерастворимые примеси, центрифугируйте 10 мин, 10000 - 13000 об/мин, перенесите супернатант в новую 1,5 мл пробирку.
  5. Добавьте 200 мкл изопропанола, перемешайте.
  6. Поместите колонку в пробирку для сбора проскока, нанесите на колонку 800 мкл лизата, центрифугируйте 60 сек, 10000-13000 об/мин. Проскок слейте и повторите процедуру нанесения и центрифугирования для остатка лизата. Проскок слейте.
  7. Нанесите на колонку 500 мкл промывочного буфера A, центрифугируйте 30-45 сек, 10000-13000 об/мин. Проскок слейте.
  8. Нанесите на колонку 500 мкл промывочного буфера B, центрифугируйте 30 сек, 10000-13000 об/мин. Проскок слейте. 
  9. Центрифугируйте пустую колонку 30 сек, 10000-13000 об/мин.
  10. Поместите колонку в новую пробирку на 1,5 мл, нанесите на колонку 50-100 мкл элюирующего буфера. Инкубируйте 1 мин при комнатной температуре, затем центрифугируйте 60 сек, 10000-13000 об/мин. Выделенная ДНК находится в элюате.

Протокол выделения ДНК из соскоба буккального эпителия

  1. Внесите в 1,5 мл пробирку 600 мкл Лизирующего компонента I, тщательно промойте в ней палочку с соскобом буккального эпителия.
  2. Добавьте 5 мкл раствора РНКазы, перемешайте.
  3. Инкубируйте полученную смесь 20 мин при 50°С. Добавьте к образцу 300 мкл Лизирующего компонента II, перемешайте.
  4. Центрифугируйте 10 мин, 10000 - 13000 об/мин, перенесите супернатант в новую 1,5 мл пробирку.
  5. Добавьте 200 мкл изопропанола, перемешайте.
  6. Поместите колонку в пробирку для сбора проскока, нанесите на колонку 800 мкл лизата, центрифугируйте 60 сек, 10000-13000 об/мин. Проскок слейте и повторите процедуру нанесения и центрифугирования для остатка лизата. Проскок слейте.
  7. Нанесите на колонку 500 мкл промывочного буфера A, центрифугируйте 30-45 сек, 10000-13000 об/мин. Проскок слейте.
  8. Нанесите на колонку 500 мкл промывочного буфера B, центрифугируйте 30 сек, 10000-13000 об/мин. Проскок слейте. 
  9. Центрифугируйте пустую колонку 30 сек, 10000-13000 об/мин.
  10. Поместите колонку в новую пробирку на 1,5 мл, нанесите на колонку 50-100 мкл элюирующего буфера. Инкубируйте 1 мин при комнатной температуре, затем центрифугируйте 60 сек, 10000-13000 об/мин. Выделенная ДНК находится в элюате.

Протокол выделения ДНК из цельной крови

  1. Смешайте в 1,5 мл пробирке 100 мкл цельной крови и 650 мкл Лизирующего компонента I. Добавьте 5 мкл раствора РНКазы, перемешайте.
  2. Инкубируйте полученную смесь 20 мин при 50°С. Добавьте 300 мкл раствора для преципитации, тщательно перемешайте содержимое путем переворачивания пробирки.
  3. Центрифугируйте 10 мин, 10000 - 13000 об/мин. Преципитат собирается в верхней части пробирки, аккуратно перенесите жидкую фазу в новую 1,5 мл пробирку.
  4. Добавьте 300 мкл Лизирующего компонента II, перемешайте.
  5. Добавьте 300 мкл изопропанола, перемешайте.
  6. Поместите колонку в пробирку для сбора проскока, нанесите на колонку 800 мкл лизата, центрифугируйте 60 сек, 10000-13000 об/мин. Проскок слейте и повторите процедуру нанесения и центрифугирования для остатка лизата. Проскок слейте.
  7. Нанесите на колонку 500 мкл промывочного буфера A, центрифугируйте 30-45 сек, 10000-13000 об/мин. Проскок слейте.
  8. Нанесите на колонку 500 мкл промывочного буфера B, центрифугируйте 30 сек, 10000-13000 об/мин. Проскок слейте.
  9. Центрифугируйте пустую колонку 30 сек, 10000-13000 об/мин.
  10. Поместите колонку в новую пробирку на 1,5 мл, нанесите на колонку 50-100 мкл элюирующего буфера. Инкубируйте 1 мин при комнатной температуре, затем центрифугируйте 60 сек, 10000-13000 об/мин. Выделенная ДНК находится в элюате.

Примечание

Если необходимо разбавить раствор при измерении концентрации ДНК, то для разбавления следует использовать только буфер ТЕ pH 8,5 или элюирующий буфер из набора. В противном случае можно получить некорректные значения A260/280 и неверно определить содержание ДНК в растворе.

Выделенную ДНК кратковременно можно хранить при +4°С. Для долговременного хранения рекомендуется -20°С.

Пример электрофореграммы ДНК, выделенной из различных источников

Пример электрофореграммы ДНК

1 — Esherichia coli; 2 — Agrobacterium tumifaciens; 3 — Bacillus subtilis; 4 — Pichia pastoris; 5 — Fusarium graminearum; 6 — Лист клевера (Trifolium); 7 — Лист тимофеевки (Phleum); 8 — Лист калины; 9 — Хвоя ели (Picea); 10 — Сердце мыши; 11 — Почка мыши; 12 — Печень мыши; 13 — Легкое мыши; 14 — Хвост мыши. Маркер длин ДНК 1 Kb Plus DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific), верхняя полоса 20 000 пн.

Кривые амплификации фрагмента гена бета-актина человека

Кривые амплификации фрагмента гена бета-актина человека

В качестве матрицы для ПЦР в реальном времени были использованы образцы геномной ДНК, выделенные из цельной крови (1,2), соскоба буккального эпителия (3,4) и лейкоцитов (5,6) (указаны пороговые циклы (Ct) и приведена электрфореграмма исходных образцов ДНК). Размер амплифицируемого фрагмента 250 пн, ПЦР в реальном времени проводили с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green I (Lumiprobe). Маркер длин ДНК 1 Kb Plus DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific), верхняя полоса 20 000 пн.

Your item has been added. View your cart or proceed to checkout
The count of items is incorrect.