Unfortunately, this page is not available in English. This is the Russian version.

Набор для выделения геномной ДНК Lumiprobe

Набор предназначен для быстрого (не более 1 часа) выделения геномной ДНК из различных объектов (грам-бактерии, ткани растений и животных, клеток крови, мицелия грибов) на спин-колонках. Максимальный выход ДНК — 20 мкг, OD 260/280 1,7-2,2.

Состав набора (рассчитан на выделение 40 образцов ДНК):

Компонент набора Количество
Колонки с сорбентом 40 шт
Пробирки для сбора проскока 40 шт
Лизирующий буфер I 1×40 мл
Лизирующий буфер II 1×20 мл
Промывочный буфер A (содержит GuHCl, гуанидиния хлорид) 1×30 мл
Концентрат промывочного буфера B (разбавляется этанолом*) 2×10 мл
Элюирующий буфер 1×10 мл
РНКаза А (10 мг/мл) 2×0,15 мл
Корунд 1×15 г

Хранить при комнатной температуре, срок хранения 1 год.

*Этанол не входит в набор

Перед началом работы

Добавьте 40 мл 96% этанола к 10 мл концентрата промывочного буфера B, поставьте отметку о добавлении этанола на крышке.

При наличии осадка в лизирующих буферах и промывочном буфере A (с GuHCl) нагрейте их не более чем до 50 С до полного растворения осадка.

Весь протокол выполняется при комнатной температуре, все центрифугирования при 10000-13000 об/мин.

Ориентировочные выходы геномной ДНК с 50-100 мг ткани или культуры клеток:

  • 10^9 клеток грам-бактерий (1 мл культуры OD600 1) — 5-10 мкг
  • Лист растений — 3-5 мкг
  • Хвоя — 2-5 мкг
  • Мицелий грибов — 2-5 мкг
  • Хвост мыши — 3-5 мкг
  • Почка мыши — 5-10 мкг
  • Сердце мыши — 2-5 мкг
  • Печень мыши — 2-5 мкг

Образцы для выделения ДНК

На 1 мл лизирующего буфера берите не больше 200 мг ткани или 4*10^9 клеток бактерий или 10^7 клеток млекопитающих. При выделении из некоторых образцов может понадобиться больше лизирующего буфера для смачивания.

Гомогенизированные образцы можно хранить в лизирующем буфере несколько недель при комнатной температуре.

В состав набора входит корунд 50 мкм. При гомогенизации прямо в лизирующем буфере в ступке с пестиком или в 1,5 мл пробирке с использованием пестика-гомогенизатора его добавление способствует полной деструкции образца и облегчает процесс гомогенизации. Гомогенизация образца в ступке с пестиком является предпочтительным методом, так как при этом обеспечивается наиболее полное разрушение тканей. Удовлетворительного результата позволяет добиться и пестик-гомогенизатор, однако выход ДНК при прочих равных условиях меньше.

Для культур клеток этап гомогенизации не нужен. Просто соберите клетки центрифугированием, ресуспендируйте их в 50-100 мкл воды и переходите к лизису.

Протокол

  • 1а.(если используется пестик-гомогенизатор). 20-100 мг ткани поместите в пластиковую пробирку на 1,5 мл, добавьте 200 мкл лизирующего буфера I, 70-100 мг корунда и гомогенизируйте образец с помощью пестика-гомогенизатора. После гомогенизации добавьте 450 мкл лизирующего буфера I. Добавьте 5 мкл р-р РНКазы, перемешайте.
  • 1б. (если используется фарфоровая ступка). В ступку поместите 100 мкл стерильной воды, собранные клетки или 20-100 мг ткани, 200 мкл лизирующего буфера I, немного корунда и гомогенизируйте смесь в ступке. После гомогенизации добавьте еще 450 мкл лизирующего буфера I, перемешайте, перенесите смесь в 1,5 мл пробирку. Добавьте 5 мкл р-ра РНКазы, перемешайте.
  1. Инкубируйте при 50°С 10-20 мин. Добавьте к образцам 350 мкл лизирующего буфера II, перемешайте.
  2. Лизат центрифугируйте на 10000-13000 об/мин 10 мин, 800 мкл супернатанта перенесите в новую пробирку на 1,5 мл.
  3. К 0,8 мл лизата добавьте 200 мкл изопропанола (не входит в набор), перемешайте.
  4. Поместите колонку в пробирку для сбора проскока, нанесите на колонку 800 мкл лизата, центрифугируйте 45-60 сек, 10000-13000 об/мин. Проскок слейте, дальнейшая работа ведется с колонкой.
  5. Нанесите на колонку 500 мкл промывочного буфера A (с GuHCl), центрифугируйте 45-60 сек, 10000-13000 об/мин. Проскок слейте.
  6. Нанесите на колонку 500 мкл промывочного буфера B (c этанолом), центрифугируйте 45-60 сек, 10000-13000 об/мин. Повторите этап 6 еще раз.
  7. Проскок слейте. Центрифугируйте 45-60 сек, 10000-13000 об/мин.
  8. Поместите колонку в новую пробирку на 1,5 мл, нанесите на колонку 100 мкл элюирующего буфера. Инкубируйте 1 мин при комнатной температуре и центрифугируйте 60 сек, 10000-13000 об/мин. Выделенная ДНК находится в вышедшем из колонки элюате.

Примечание

Если необходимо развести раствор при измерении концентрации ДНК, то следует это делать только в буфере ТЕ pH 8,5 или элюирующем буфере, иначе можно получить неточные значения A260/280, что приведет к неверному определению содержания ДНК в растворе.

Хранить ДНК кратковременно при 2-4°С, долговременное хранение при -20°С.

Пример электрофореграммы ДНК, выделенной из различных источников

Пример электрофореграммы ДНК

1 — Esherichia coli; 2 — Agrobacterium tumifaciens; 3 — Bacillus subtilis; 4 — Pichia pastoris; 5 — Fusarium graminearum; 6 — Лист клевера (Trifolium); 7 — Лист тимофеевки (Phleum); 8 — Лист калины; 9 — Хвоя ели (Picea); 10 — Сердце мыши; 11 — Почка мыши; 12 — Печень мыши; 13 — Легкое мыши; 14 — Хвост мыши. Маркер длин ДНК 1 Kb Plus DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific), верхняя полоса 20 000 пн.

Your item has been added. View your cart or proceed to checkout
The count of items is incorrect.